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【1001問】問題247:有沒有體外培養的神經纖維染色技術？

發表時間：2023-02-08 14:07

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有沒有體外培養的神經纖維染色技術？
Bodian蛋白銀染色法是一種顯示神經纖維的經典銀浸鍍技術，早期是應用在神經組織的石蠟切片上，后將之應用在神經組織的體外培養標本，用以顯示神經突起，按經典的Bodian蛋白銀方法對培養的神經組織 （交感神經節）標本進行染色，雖然有時亦可以清楚地顯示神經纖維，但其方法較不穩定，致使不少培養標本制作不夠理想或失敗。經過一段時間的摸索，對經典的Bodian蛋白銀染色方法進行一些改良，不僅獲得滿意的結果，而且成功率高?，F將其改良法介紹給大家：
1.標本處理：
將神經纖維培養物放入10%中性甲醛溶液內，固定1～2小時。
2.試劑制備：
（1）0.5%蛋白銀水溶液：蛋白銀0.5g+蒸餾水100ml。
（2）還原液：焦性沒食子酸2g+蒸餾水45ml+乙醚：純乙醇 （1∶1）55m l+1%硝酸0.2m l。
（3）胺尼林油乙醇溶液：50%乙醇100ml+胺尼林油2小滴。
3.染色方法：
（1）將神經纖維培養物自來水沖洗1～2小時，再浸泡蒸餾水0.5小時以上。
（2）放入0.5%蛋白銀水溶液內，在37℃的恒溫箱內孵育24～48小時。蛋白銀水溶液臨用時配制，配制方法是將蛋白銀撒于燒杯中的蒸餾水表面，不要攪拌，置于37℃恒溫箱內直至溶解。
（3）蒸餾水洗幾次。
（4）在蓋片培養物上，加入數滴預溫 （45～50℃）的還原液，還原數分鐘，還原液臨用時配制。
（5）蒸餾水洗幾次。
（6） 50%乙醇30秒。
（7）1%氯化金溶液數秒鐘 （或在鏡下觀察調色滿意為止）。
（8）胺尼林油乙醇溶液15秒。
（9）5%硫代硫酸鈉溶液15秒。
（10）蒸餾水洗幾次。
（11） 95%乙醇。
（12）10%乙醇和二甲苯，每道兩次，每次30分鐘，封片。
4.結果判定：
神經纖維 （軸突）呈現黑色，背景淡紫色，施萬細胞及成纖維細胞被染上較淺的棕黑色。
5.注意事項：
（1）本法改良的重點是還原液，改良前因其還原蛋白銀的能力較強，故容易使神經纖維染黑。本法的還原液臨用時配制，染色效果最佳，這與原法的還原液至少要配好三天后才能應用不同，因為這種還原液在加溫后會揮發。故應用時間較長，會降低藥效。還原時，只需在每張蓋片培養物上加入數滴還原液，就足以顯效，這較原法節省藥物 （原法要用大量還原液，曾介紹過每片用100ml）。
（2）不同商品的蛋白銀效果差別較大，Gurr（英國）和Merck（德國）兩種商品的蛋白銀，以前者效果好，后者效果不佳。
（3）蛋白銀用量比經典Bodian蛋白銀法減少一半，并可省略了加用銅絲，能同樣達到較好的染色效果。
（4）本法整個染色過程較易掌握，因而制作標本的成功率高，并能夠清楚地顯示出神經纖維上的細微結構。

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